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转录组学研究揭示绞股蓝生物合成关键基因

时间:2020-03-16 19:40:02 来源:派森诺
转录组学研究揭示绞股蓝生物合成关键基因

绞股蓝是多年生匍匐草本植物,在亚洲广泛种植,有很多重要的药用属性。绞股蓝皂苷,是绞股蓝中的主要有效成分,已被充分研究。考虑到绞股蓝重要的药用功能,做绞股蓝的转录组信息研究是很有必要的,有利于开展以后的转录调控研究。广西医科大学吴耀生教授团队和上海派森诺合作,通过绞股蓝测序,总共获得了50,654,708个unigenes。通过计算unigene的表达量,并将数据和五个常用数据库进行比对,获得unigenes不同方面的注释信息。发现DESeq分析结果中FPS,SS和SE酶表现出不同的表达水平。相对于根和茎,叶片中FPS,SS和SE的表达量是最高的。本研究通过对自然环境生长的绞股蓝进行转录学分析,发现unigene的表达,酶的表达(FPS,SS和SE)和绞股蓝皂苷的分布是一致的。

实验背景

绞股蓝的主要有效组成是绞股蓝皂苷,它有多种多样的生物活性,这可以解释绞股蓝为什么会在天然药学中有广泛应用。例如,绞股蓝皂苷可以通过增加胰岛素降低血糖。还有其他功能应用像抗癌,抗炎症,抗焦虑,降血脂,保护肝细胞,神经保护和免疫保护等等。三帖合成途径可以分解为三个部分:1、IPP(异戊烯基焦磷酸)或者DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸酯)合成;2、鲨烯合成和环化;3、功能化反应获得鲨烯复合物(图1)。和人参皂苷一样,绞股蓝皂苷在药学和健康学中有很多重要应用。但是绞股蓝皂苷和人参皂苷相比,有更高的异质性,其中有超过169种绞股蓝皂苷。绞股蓝比人参中的三萜化合物种类高出5倍。这可能和三帖合成途径中的基因与酶的差异表达相关。

图1 三帖合成途径

实验结果

1、测序与组装

高通量测序获得352,999,296条原始reads,过滤掉接头和低质量序列,剩余249,488,643条clean reads。组装之后得到1,119,964个contigs,总长度达249,488,543bp。将contigs拼接成转录本,得到159,858,904个转录本序列。和NR数据库比对后,获得50,654,708个unigene,平均长度755bp。

2、注释结果

用NR,GO,KEGG,eggNOG和Swiss-Port数据库注释unigenes。整体看来,eggNOG中鉴定率最高,达到96.57%,KEGG中鉴定率最低,只有8.77%。

表1 unigenes 注释结果

3、unigene表达分析

统计unigene的RPKM,做RPKM的密度分布图。发现中等范围表达量的unigenes的AUC(曲线下面积)占绝大部分,低表达或者高表达的unigenes的AUC是少部分的(图2)。通过密度分布图发现,纤维根中的unigenes要比茎和叶片中的unigenes表达量高。尽管茎和叶片有相似的unigene表达量,茎中的表达量稍微高于叶片中的表达量。另外分析编码FPS,SS,SE和β-AS(β-香树精合成酶)的unigenes的表达,发现这些unigenes在叶片中高表达,在纤维根中低表达,在茎中要比纤维根中表达量高。编码β-AS的unigene在叶片中的表达量是纤维根中的将近125倍。通过DESeq软件做两两比较分析测序数据,通过韦恩图展现出差异表达的unigene的分布情况(图3)。

表2 样品中unigenes的RPKM值

表3unigenes两两比较上下调基因统计结果

图2 unigenes的RPKM密度分布图

图3差异unigenes的韦恩图

4、绞股蓝中皂苷的含量分布

分光光度法测定绞股蓝的皂苷含量分布。所有的样品中叶片的皂苷含量最高(3.189%),在茎(0.365%)或者纤维根(0.172%)中皂苷含量比较低。

表4 绞股蓝中皂苷含量分布

5、三帖合成途径中酶的表达分析

基于KEGG通路分析,将涉及三铁合成通路有关的酶分为三类:1、IPP或者DMAPP合成相关的酶;2、鲨烯合成和环化相关的酶;3、鲨烯功能化反应中的酶。文中主要关注的是FPS,SS和SE三种酶,它们在三帖合成和环化中起重要作用。首先FPS比较分析结果中,只有纤维根和叶片中的表达比较有差异。再次,SS比较分析结果中,两组分析结果中有差异,表明叶片中的表达要高于纤维根和茎。最后,在SE比较分析结果中,叶片中的表达高于茎和纤维根,而 且纤维根中的表达高于茎(图4)。

图4 FPS,SS,SE中基因的RPKM

总结

在unigene功能注释,RPKM表达量统计和绞股蓝含量测定之后,分析unigene表达,酶(unigene的产出物)的表达和绞股蓝皂苷的含量分布之间的关联,发现unigene和酶的表达与皂苷含量分布呈正相关。也就是说样本(纤维根,茎,叶片)中unigene和酶(FPS,SS和SE)的表达取决于皂苷含量的分布。这一结论,有利于绞股蓝中其他次级代谢产物的深入研究。


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